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    ELISA檢測操作注意事項問題及解決方案

    發(fā)布時間: 2022-08-17  點擊次數(shù): 5205次

    以下是影響ELISA檢測的關鍵因素,也是眾多ELISA 用戶在實驗中經(jīng)常遇到的問題及解決方案:

    問題:為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作?

    解決方案:溫度是ELISA結(jié)合反應的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應,實驗前務必將所有試劑平衡至室溫,包括檢測樣本。避免因溫度的動力學反應差異而導致ELISA檢測結(jié)果的不準確。


    問題:為什么標準曲線線性較差?
    解決方案:按照推薦方式保存標準品;溶解標準品之前需短暫離心,*收集粉末;確保標準品*溶解和混勻(大約10min),然后再進行后續(xù)的系列稀釋步驟,確保每一步都充分混勻且移液;顯色的恰當終止;選擇合適的數(shù)學擬合方程繪制標準曲線。


    問題:ELISA實驗為什么必須設置復孔?
    解決方案:為獲得更準確的實驗結(jié)果,強烈建議標準品及樣本進行復孔檢測。


    因為復孔檢測可以:

    計算平均值,確保實驗結(jié)果更準確;

    解決實驗中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象;

    計算CV值,對實驗的操作和試劑盒的精密度進行評估。

    問題:為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩?如何振蕩?


    解決方案:振蕩孵育使反應更充分,振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標96孔微孔板振蕩器。
    孵育過程振蕩,可以加快、加強抗原抗體間的相互碰撞接觸,使得反應過程更加*,OD值通常會比未振蕩孵育的結(jié)果要高;洗滌過程振蕩,可以使洗板更干凈,在很大程度上能降低背景值,同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。


    具體操作請參見說明書或致電研域生物。

    問題:何時終止ELISA反應?

    解決方案:ELISA實驗zui終需要酶催化底物顯色反應來完成,在zuijia時間終止反應是ELISA實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶反應系統(tǒng)中,當zui高濃度標準品顏色不再變深,倒數(shù)2-3個濃度標準品顏色開始有淺藍色時,便需要終止反應;或者也可以根據(jù)zui高濃度標準品孔在620nm的OD值來決定,OD620=0.9-0.95之間時即可終止。


    問題:為什么酶標儀讀數(shù)時必須選用雙波長?

    解決方案:首先,酶標儀使用前務必預熱10-15min,使測讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次,ELISA實驗采用雙波長測定吸光度,可以排除單波長檢測時的測定干擾(標本的濃度,干擾色等)。一般采用zui大波長作為參照波長,在參照波長下,檢測物的吸光值zui小,檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收;因此,雙波長測定,可zui大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標儀讀數(shù)帶來的誤差,以保證實驗數(shù)據(jù)的準確度。


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