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    大鼠 (Rat) 雌激素 (Estrogen) ELISA 檢測試劑盒

    發(fā)布時(shí)間: 2009-12-18  點(diǎn)擊次數(shù): 2267次

     

    試驗(yàn)原理
    Estrogen試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).已知Estrogen濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將Estrogen和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中Estrogen的濃度呈比例關(guān)系。
     
    試劑盒內(nèi)容及其配制

    試劑盒成份(2-8℃保存)
    96孔配置
    48孔配置
    配制
    96/48人份酶標(biāo)板
    1塊板(96T
    半塊板(48T
    即用型
    塑料膜板蓋
    1
    半塊
    即用型
    標(biāo)準(zhǔn)品:80ng/ml
    1瓶(0.6ml
    1瓶(0.3ml
    按說明書進(jìn)行稀稀
    空白對照
    1瓶(1.0ml
    1瓶(0.5ml
    即用型
    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液
    1瓶(5ml
    1瓶(2.5ml
    即用型
    生物素標(biāo)記的抗Estrogen抗體
    1瓶(6ml
    1瓶(3.0ml
    即用型
    親和鏈酶素-HRP
    1瓶(10ml
    1瓶(5.0ml
    即用型
    洗滌緩沖液
    1瓶(20ml
    1瓶(10ml
    按說明書進(jìn)行稀釋
    底物A
    1瓶(6.0ml
    1瓶(3.0ml
    即用型
    底物B
    1瓶(6.0ml
    1瓶(3.0ml
    即用型
    終止液
    1瓶(6.0ml
    1瓶(3.0ml
    即用型
    標(biāo)本稀釋液
    1瓶(12ml
    1瓶(6.0ml
    即用型

     
    自備材料
    1. 蒸餾水。
    2. 加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul
    3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
     
    安全性
    1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
    2. 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
    3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
     
    操作注意事項(xiàng)
    1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。
    2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
    3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
    4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時(shí),避免使用帶金屬部分的加樣器。
    5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
    6. 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
    7. 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時(shí)間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
    8. 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
    9. 按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
     
    樣品收集、處理及保存方法
    1、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
    2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
    3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
    4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
    5、 保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
     
    試劑的準(zhǔn)備
    1. 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行:

    80 ng/ml
    (6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
    40 ng/ml
    (5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
    100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    20 ng/ml
    (4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
    100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    10 ng/ml
    (3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
    100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    5.0 ng/ml
    (2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
    100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    2.5 ng/ml
    (1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)
    100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
    0 ng/ml
    (空白對照)
    原始濃度不用稀釋直接加入50ul

     
    2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。
     
     
    操作步驟
    1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
    2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
    3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時(shí)。
    4. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
    5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
    6. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
    7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
    8. 取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
    9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。
     
    建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

     
    標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml
     
    A
    80
    80
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    B
    40
    40
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    C
    20
    20
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    D
    10
    10
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    E
    5.0
    5.0
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    F
    2.5
    2.5
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    G
    0
    0
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    H
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品
    樣品

     
     
    局限
    6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。
     
    試劑盒性能
    1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990
    2. 特異性:不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
    3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%
     
    結(jié) 果 判 斷
    1、儀器值:于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD
     
    2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的Estrogen標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的Estrogen含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
     
    3檢測值范圍:0-80ng/ml
     
    4、敏感度: 0.1 ng/ml
     
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