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    真菌毒素檢測技術與產品服務(4)

    發布時間: 2009/3/27  點擊次數: 2464次
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    詳細介紹:

    液相色譜法對飼料中赭曲霉毒素的測定
     
    摘要:研究了液相色譜法測定飼料原料和配合飼料中赭曲霉毒素的方法。樣品經已腈水(8416)提取,提取液通過赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮,C18色譜柱分離,熒光檢測器檢測,外標法定量。對添加兩個濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進行添加回收實驗,平均回收率為99.12%103.09%,變異系數RSD分別為0.281%、1.214%,zui低檢測限為0.20ng/kg,方法簡便易行,準確精密度高,值得推廣。
     
    Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in feed .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with    ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are   satisfactory.
    Keywords: HPLC pretreatment ochratoxin A
     
    霉菌遍布世界各地,種類繁多,依生活習性,分為倉儲霉菌和田間霉菌,前者指儲存原料和飼料在適宜的溫度、濕度下產生的霉菌,zui適宜溫度為25-30℃,相對濕度80-90%。赭曲霉毒素是溫暖地區zui重要的倉儲毒素,廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。廣東地處亞熱帶,溫濕度十分適宜霉菌的生長,據有關調查該毒素污染在原料和配合飼料中普遍存在,陽性率大于60%2。赭曲霉毒素危害很大,致癌性*。據報道,每千克飼料中含有0.2-0.3克,就可使雞中毒,zui常見的臨床表現有:鈣磷吸收障礙,骨骼脆弱,蛋殼鈣化不全,破蛋率高,皮下出血,容易挫傷。對家畜主要攻擊腎臟、免疫系統和造血系統,肝臟變得脆弱,劇渴,生長遲緩,多尿、下痢、糖尿癥。根據中國國家有關規定,赭曲霉毒素的zui高*為:20ug/kg.
    現常用的檢測方法多為薄層色譜和酶聯免疫法,薄層色譜法操作繁瑣,污染大、定量差,耗時長,而酶聯免疫法雖操作簡單,但存在假陽性,準確性欠佳,此液相色譜法操作簡便,快速,準確靈敏度高,不失為一種好方法。
    1.實驗部分:
    1.1試劑和儀器
    色譜純冰醋酸(分析純)去離子水
    赭曲霉標準液  PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱  液相色譜儀 熒光檢測器
    1.2步驟
    1.2.1  取樣:取代表樣品5kg,粉碎,充分混合均勻,四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻,充分混合非常重要,必要時取樣量加大,有地方建議取15kg
    1.2.2  提?。喝?/span>25g粉碎樣品于250ml三角燒瓶內,加100ml已腈水(8416),在振蕩器上振蕩1小時,用定量濾紙過濾。
    1.2.3  標準準備:將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個棕色瓶子里吹干,用10ml的流動相進行溶解,渦旋1分鐘,此為50ng/ml的赭曲霉毒素標準液;另將1 ml10ug/ml
    的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內吹干,用10ml的流動相溶解,渦旋1分鐘,此為1ug/ml的赭曲霉加標標準溶液。
    1.2.4   凈化濃縮:取7ml的樣品提取液用PuriToxSR 130赭曲霉毒素凈化柱,然后將凈化液轉移4ml的凈化液到另一試管,60℃水浴中氮氣吹干,用400ul的流動相(60/40/1/已腈/已酸)溶解,渦旋30min ,轉移到1.5ml的離心管內10000轉離心5分鐘,轉移350ul 的清潔樣品進入液相。
     
    1. 3儀器條件
     
    Waters2695液相色譜儀,2475熒光檢測器
    色譜柱:NovapakC18(5um) 3.90*150mm   Waters PAHC18(5um)4.6*150mm
    流動相60/40  /已腈
    流速0.5ml/min  運行時間20min
    柱溫:40
    進樣體積:60ul
    EX:330nm      EM:460nm
     
    2.0測定結果
     
    2.1 標準曲線及回歸方程:取制定好的50ng/ml的標準溶液,用流動相分別稀釋成125、102030、50ng/ml的濃度,上液相色譜進行檢測,根據檢測的峰面積對應相應濃度制成標準曲線。相關系數為0.9995,回歸方程是Y=1.11×105X-1.85×103,檢測限:0.20ng/kg.
     
    1.   標準曲線的基本參數:
    Tab.1 Regression equation
    濃度范圍
    Concn.Rangeng/ml
    1.0
    2.0
    5.0
    10.0
    20.0
    30.0
    50.0
    峰面積
    Peak area
    103454.993
    210799.985
    515389.964
    1064099.926
    2285364.840
    3442139..760
    5463738.891
    相關系數
    Correlation
    0.9995
    回歸方程
    Regression equation
    Y=1.11×105X-1.85×103
    檢測限
    Limit of detection
    0.20ng/kg3倍信噪比計算
     
     
     
    2.2不同濃度添加回收實驗取玉米樣品1,分別做兩個濃度的添加回收實驗,結果見表2。
    2.兩個濃度的樣品添加回收實驗結果表:
    Tab.2 Recovery test
    組分
    Ingtedient
     
    本底值
    Known value
    (ng/ml)
    添加標準液的體積
    10ul
    35ul
    赭曲霉毒素
    0
    添加處理后理論濃度
    Added
    14.28ng/ml
    50.0ng/ml
    添加次數
    1
    2
    3
    4
    5
    1
    2
    3
    4
    5
    添加后測得濃度(ng/ml)
    Found
    14.18
    14.16
    14.13
    14.20
    14.10
    52.06
    52.16
    51.13
    51.68
    50.69
    回收率
    Recovery
    (%)
    99.30
    99.16
    98.95
    99.44
    98.74
    104.12
    104.32
    102.26
    103.36
    101.38
    平均值
    Average value
    99.12
    103.09
    RSD%
     
    0.281
     
    1.214
     
    2.3精密度實驗選擇不同含量的玉米樣品兩份分別平行測定8,結果見表3
     
    3.精密度實驗結果
    Tab.3 Precision test
    檢測次數
    1
    2
    3
    4
    5
    6
    7
    8
    平均值
    RSD
    樣品1測定值
    Sample 1 Found(ng/ml)
    11.23
    11.46
    11.41
    11.36
    11.87
    11.97
    11.67
    11.75
    11.59
    2.27
    樣品2測定值
    Sample 2 Found(ng/ml)
    28.57
    28.62
    28.68
    28.98
    28.87
    28.12
    28.92
    28.53
    28.66
    0.963
    3.0結論
     

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