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    核酸提取、PCR、熒光定量PCR常見問題解答

    發(fā)布時間: 2010/5/26  點擊次數(shù): 1792次
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    *部分 核酸DNA和RNA提取常見問題分析

    1.       RNAfixer的工作原理?

    浸入組織,抑制RNase的活性。運輸方便,是非液氮類的一種樣品儲存液。

    2.       對于內(nèi)源RNase豐富的組織和樣品,如何消除RNase?

    可以在提取時候多加裂解液,比如4:1等。

    3.       TRIpure and RNApure區(qū)別?

    胍鹽類的裂解液一樣,RNApure附加有離心柱,和漂洗液,是Kit。

    TRIpure只是裂解液。

    4.       凝血的gDNA和RNA的提取與新鮮血的提取不同?

    需加一個分離柱(separate column)分開凝血。

    5.       microRNA提取和定量?

    過2次離心柱,得到200bp一下的小RNA。可以測定OD定量。

    6.       血清,血漿,血液RNA提取的區(qū)別?以及Viral RNA提取的方法?

    液體類樣品RNA提取用TRIpure LS。一般血清、血漿是無細胞樣品,含游離的RNA,量比較少,建議加Carrier RNA在提取時候。

    病毒RNA提取加Carrier RNA在提取時候,BioTeke有專門的病毒RNA提取試劑盒。

    7.       通用植物RNA提取常見問題:蛋白質(zhì)污染?

    DNA污染-DNaseI消化(Kit does not provide it, please get it from other companies.)

    8.       真菌RNA提取

    可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。

    9.       DNA cleanup from gel and PCR, 區(qū)別?

    膠回收含有一個溶膠液。多功能膠回收可以用于膠回收和PCR產(chǎn)物回收。

    10.    土壤DNA提取優(yōu)點?

    無需要機械破碎樣品和過柱的純化方式,減少DNA的鍛煉和得率,達到實驗目的。

     

    第二部分PCR/RT-PCR常見問題解答

    1.     二次PCR無目標產(chǎn)物,電泳孔道亮?

    Template稀釋和重新設(shè)計引物

    2.     microRNA的反轉(zhuǎn)錄問題?

    microRNA反轉(zhuǎn)錄和普通的mRNA的反轉(zhuǎn)錄不一樣。現(xiàn)在常見的microRNA反轉(zhuǎn)錄引物有2種,一個是step-loop結(jié)構(gòu);另外一種是3末端加polyA后,再用oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄。BioTeke有microRNA提取和2-step real-time PCR Kit。

    3.     cDNA的合成(RT)電泳,以及cDNA第二鏈的合成問題?

    2-5uLcDNA產(chǎn)物電泳有模糊條帶出現(xiàn)。第二鏈合成也有專門的試劑盒。BioTeke現(xiàn)在沒有此類產(chǎn)品。

    4.     Power Mix擴增不成功因素?

    產(chǎn)品或者引物或者目的基因的不表達。

    5.     RT-PCR沒有擴增產(chǎn)物?

    可能是引物,模版,產(chǎn)品等。

     

     

    第三部分Real-time qPCR 常見問題分析

    1.     做標準曲線時候,可否用2個不同體系濃度的稀釋分別對于內(nèi)參和目的基因?

    建議用同樣稀釋倍數(shù)做曲線,因為模板濃度會影響擴增效率。

    2.     熔解曲線中,Tm不出現(xiàn)在80度左右?

    擴增片段100bp左右的,一般應該出現(xiàn)在80度左右。如果低于此溫度出現(xiàn),可能是模板降解。

    3.     擴增曲線沒有Ct值,僅僅一條斜線?什么原因?

    模板濃度過低或者模板降解。

    4.     如果內(nèi)參和目標基因表達量差別比較大,也就是目的基因的表達量少,

       Ctcon=15,Cttarget=38,可否應用?

    可以用于數(shù)據(jù)分析。因為表達量低,從而用過高模板進行擴增,從而同內(nèi)標的模板不同,反而會增大數(shù)據(jù)統(tǒng)計的誤差。

    5.     引物濃度可否是50nM,是否太低?

    如果擴增曲線和熔解曲線比較好,這個濃度當然可以。如果更低,擴增結(jié)果好的情況下,同樣可以運用。

    一句話,所有的模板、引物等濃度盡量不要用高的,會影響擴增效率。

    6.     miRNA多個擴增時候,如果一個的擴增效果比較,其它熔解曲線不止一個峰,如何解決?

    Primer對于miRNA是專一的。所以重新設(shè)計引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等。反應體系會影響反應產(chǎn)物的。

    7.     相對定量方法,如果用Ct值比較,是各個樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好?

    相對定量的方法各有優(yōu)缺點,主要取決于實驗的目的和材料的準備。如果是材料群體個體差異不大,這2種方法基本沒有很大的區(qū)別;如果是個體差異比較大,建議用雙標準曲線做。就是分別做內(nèi)參和目的基因的標準曲線,分別帶入Ct值計算。

    8.     熔解程序可否不加?

    如果是擴增效果好,特異擴增,可以不加熔解程序;但建議做好加上。

    9.     擴增反應體系5uL,擴增效率低,什么原因?

    反應體系小,各種因素的影響比較大,比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會影響擴增效率的。

    10.  如何減少非特異性擴增的干擾?

    設(shè)計一對好引物,提高primer的退火溫度,以及設(shè)定吸光溫度。


     

     

     

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