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    利用Ion半導(dǎo)體測(cè)序開展基因表達(dá)譜分析

    發(fā)布時(shí)間: 2012-11-05  點(diǎn)擊次數(shù): 2684次

                 研究顯示雜交芯片可產(chǎn)生大約兩百萬(wàn)個(gè)已定位的讀取[7],但也有研究證實(shí),即使讀取數(shù)目過(guò)億,提高讀取數(shù)目仍然繼續(xù)增加其信息量 那么,究竟Ion PGM™測(cè)序儀生成多少個(gè)100 base讀取能相當(dāng)于一個(gè)基因表達(dá)微陣列芯片呢?在白皮書[9]中我們對(duì)Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays (HG-U133 Plus 2.0)的芯片質(zhì)量控制(MAQC)的微陣列數(shù)據(jù)與Ion PGM™系統(tǒng)生成的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。圖1顯示了Ion PGM™測(cè)序儀數(shù)據(jù)按照不同檢測(cè)閾值下所得的基因數(shù)和微陣列芯片所能檢測(cè)到的基因數(shù)。當(dāng)采用zui嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測(cè)閾值即每個(gè)基因≥10讀取時(shí),兩百萬(wàn)個(gè)來(lái)自Ion PGM™測(cè)序儀的已定位讀取所能檢測(cè)到的基因數(shù)超過(guò)了微陣列芯片能檢測(cè)的基因。

                 當(dāng)讀取計(jì)數(shù)閾值放寬到≥5讀段數(shù)/基因時(shí),僅僅1百萬(wàn)個(gè)Ion RNA-Seq已定位讀取所能檢測(cè)到的基因數(shù)就超過(guò)了芯片的基因檢測(cè)數(shù)。利用來(lái)自Ion PGM™測(cè)序儀的2百萬(wàn)個(gè)平均讀取所能檢測(cè)到的顯著差異表達(dá)基因數(shù)(sig DEGs)要多于微陣列芯片所能檢測(cè)到的sig DEGs數(shù)。在p ≤0.05和倍數(shù)變化f≥2標(biāo)準(zhǔn)下,在HBRR和UHRR樣本中Ion PGM™測(cè)序儀得到的sig DEGs數(shù)為4,630,而相比之下芯片得到的sig DEGs數(shù)為4,198將Ion PGM™測(cè)序儀生成的兩百萬(wàn)個(gè)已定位讀取所產(chǎn)生的基因差異表達(dá)結(jié)果與qPCR結(jié)果相比較,發(fā)現(xiàn)qPCR 和RNA-Seq得到的sigDEGs倍數(shù)變化的對(duì)數(shù)值的Pearson相關(guān)系數(shù)(R)超過(guò)0.95。

                 在Ion PGM™平臺(tái)進(jìn)行RNA-Seq實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于,能夠應(yīng)用ERCC RNA Spike-In Mix對(duì)轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)靈敏度進(jìn)行評(píng)估。這些ERCC轉(zhuǎn)錄本混合物是一些含多聚腺苷酸化且無(wú)標(biāo)記的RNA,該混合物經(jīng)過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(NIST)鑒定,是評(píng)估RNA測(cè)量系統(tǒng)性能的工具,能控制實(shí)驗(yàn)可變因素。這些ERCC轉(zhuǎn)錄本的GC含量經(jīng)過(guò)平衡,更貼近真核生物內(nèi)源性mRNA的特征,它們的長(zhǎng)度范圍在250 到2,000個(gè)核苷酸之間。ERCC轉(zhuǎn)錄本混合物的含量構(gòu)成經(jīng)特殊設(shè)計(jì),能代表一個(gè)大動(dòng)態(tài)范圍的表達(dá)水平。ERCC ExFold RNA Spike-In Mix可用于評(píng)估基因差異表達(dá)的檢測(cè)靈敏度。這些質(zhì)控RNA使用戶得以直接評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量、檢測(cè)靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍以及表達(dá)倍數(shù)變化。劑量響應(yīng)散點(diǎn)圖顯示,ERCC相對(duì)濃度的對(duì)數(shù)值與已定位讀取數(shù)的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系(圖2)。利用這些外部RNA質(zhì)控有助于將來(lái)自合作實(shí)驗(yàn)室所產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行直接比較。

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