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    ELISA試劑盒有哪些操作應用領域

    發布時間: 2017-10-30  點擊次數: 1232次

    ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查,而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此,也適合于血清流行病學調查。ELISA法是免疫診斷中的一項新技術,現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定,根據已經使用的結果,本法不僅可以用來測定抗體,而且也可用于測定體液中的循環抗原,所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用范圍日益擴大,可概括四個方面:
    1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。
    2、研究抗酶抗體的合成。
    3、顯現微量的免疫沉淀反應。
    4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。
    操作流程如下:
    (1)待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl,每種樣品設3個平行孔;設兩個陰性對照孔,每孔加未處理組的細胞裂解液100μl;另設一個空白對照孔,加入純細胞裂解液100μl。 (2)酶標板置4℃,包被。
    (3)洗板:吸干孔內反應液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動。甩去孔內液體后在吸水紙上拍干。重復洗滌3-4次。
    (4)陰性對照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。
    (5)酶標板置37℃培養箱的濕盒內,孵育60min。
    (6)洗板,同(4)。
    (7)每孔加1:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 100μl。
    (8)酶標板置37℃培養箱的濕盒內,孵育60min。
    (9)洗板,同(4)。
    (10)每孔加TMB顯色液 100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應15-20min。
    (11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應。
    (12)分別測450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2,zui終測得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
    (13)數據處理:在得出標本(S)和陰性對照(N)的 OD值后,計算S/N值。S/N≥2.1為陽性判定標準。
    注:所用溶液配方
    (1) PBS:稱取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?12H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl,加雙蒸水至1000ml。
    (2)包被緩沖液:稱取1.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3,加雙蒸水至 1000m1。
    (3)洗滌液(PBST):含0.05% Tween-20的PBS。
    (4)稀釋液:含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS,主要用以稀釋抗體、標準品、樣品。
    (5)TMB顯色液:稱取1.84g Na2HP04.12H20, 0.51 g檸檬酸,加雙蒸水至1O0ml,配成檸檬酸-磷酸緩沖溶液。用10.5 ml 檸檬酸-磷酸緩沖溶液溶解1錠TMB,再加入35μl 3% H2O2
    (6)細胞裂解液:1% TritonX-100,137mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF,pH 7.4。(其中PMSF溶于異丙醇中,配成1O mmo/L,-20℃ 貯存備用。

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